Разрешение липидов в живых клетках: новый прорыв в гиперспектральной фотоакустической микроскопии среднего ИК-диапазона

Липиды — это не только структурные компоненты клеточных мембрани молекулы, запасающие энергию; онитакже тесно связаны с возникновением и развитием рака, ожирения, диабета, сердечно-сосудистыхи нейродегенеративных заболеваний. Однако задача непосредственногонаблюдения и различения различных типов липидов в живых клетках долгое время сопряженас техническими трудностями. Традиционные методы флуоресцентногомечения ограничены эффективностью и специфичностью маркировки,а также риском нарушения клеточных функций, в товремя как оптические методы, не требующие введения меток, зачастую не позволяют различать молекулы липидов со схожей химическойструктурой.

В журнале *Nature Methods* опубликованоисследование, представляющее технологию под названием «Гиперспектральная фотоакустическая микроскопия в области "отпечатков пальцев"» (hyFOPM). Используямоды колебаний одинарных связей в среднеинфракрасном диапазоне,соответствующем области «отпечатков пальцев» (характерных спектральных признаков), этатехнология позволяет обнаруживать сфингомиелин (SM) и холестерин (Chol) и получать их динамические изображения в живых клеткахбез использования меток.

Технические принципы

Большинство методов оптической визуализациибез использования меток (бесметковых методов) опираются на сигналы в областивалентных колебаний связей C–H (примерно 2800–3000 см⁻¹); однакоспектральныеполосывэтомдиапазоневесьмасхожидляразличныхлипидов, что затрудняет ихвзаимное различение. Напротив, область «отпечатков пальцев» в среднеминфракрасном диапазоне (900–1730 см⁻¹) содержитбольшеинформацииоколебанияходинарныхсвязей, отражающейуникальнуюструктурумолекул—например, характерныеполосы поглощения амидных и сложноэфирных связей, атакже стероидных колец.

На этом принципе основана конструкциясистемы hyFOPM. В качестве источника возбуждения в ней используетсяперестраиваемый квантово-каскадный лазер, охватывающий диапазон 900–2932 см⁻¹соспектральнымразрешением 2 см⁻¹. Лазерныеимпульсывозбуждаютобразец, генерируя фотоакустические сигналы, которыерегистрируются ультразвуковым преобразователем для построения гиперспектральныхизображений. Система обладает пространственным разрешениемоколо 4,3 мкм, что позволяет получатьизображения на уровне отдельных живых клеток.

Валидация липидных моделей

Для проверки работоспособности технологии исследовательская группасначала подготовила двумерные модели липидных растворов, содержащиехолестерин (Chol), ненасыщенный фосфатидилхолин (DOPC) и сфингомиелин (SM).

• Сравнение спектральных характеристик

Спектры в области «отпечатков пальцев» (fingerprint region), полученные с помощью метода hyFOPM, хорошо согласуются с результатамиATR-FTIR (ИК-спектроскопии нарушенного полного внутреннегоотражения). Три типа липидов демонстрируют различимые спектральные пики: холестерин характеризуется интенсивным пиком поглощения,соответствующим деформационным колебаниям стероидного кольца (1056 см⁻¹); для DOPC характеренпиквалентныхколебанийсвязи C=O сложноэфирнойгруппы (1731 см⁻¹); аспектрсфингомиелинасодержит полосы «амид I», «амид II» и полосудеформационных колебаний групп CH₂жирныхкислот (при 1645, 1555 и 1464 см⁻¹соответственно).

• Возможности спектрального разделения компонентов и классификации

При использовании всего 15 волновых чиселиз области «отпечатков пальцев» длялинейного разделения спектральных вкладов (linear unmixing) перекрестноевлияние (crosstalk) между холестерином и сфингомиелиномоказывается близким к 0%, тогда как для DOPC оно составляет 23%. Напротив, уровень перекрестного влияния значительно возрастает при использовании 7 волновых чисел из области валентных колебаний связей C-H. Дальнейший анализ методом линейного дискриминантного анализа (LDA) показывает, что средняя точностьклассификации достигает 96% при использовании данных либоиз области «отпечатков пальцев», либоиз области C-H, и возрастает до 97% прииспользовании всего набора волновых чисел.

• Модели гигантских униламеллярных везикул(GUV)

В ходе исследования были подготовлены три типа GUV для имитации клеточных мембран: модель 1 — смесь SM и Cholв соотношении 1:1, образующая плотную упорядоченнуюмембрану; модель 2 — смесь DOPC, SM и Chol в соотношении 2:2:1, где сосуществуют жидко-упорядоченная и жидко-неупорядоченная фазы; и модель 3 — чистый DOPC, образующийнеупорядоченную жидкостную мембрану. Изображения, полученные методом hyFOPM начастоте 2852 см⁻¹, морфологическисогласуютсясизображениями, полученнымиспомощьюфлуоресцентногоокрашивания красителем Nile Red. Спектральныехарактеристики различных везикул соответствуют спектрам чистых липидов, что подтверждает возможность идентификации отдельных компонентовв составе смешанных мембран.

• Применение для контроля качества

Выполнив спектральные измерения на 10 гигантскихуниламеллярных везикулах (GUV) каждого типа и построив тройныефазовые диаграммы, исследовательская группа обнаружила, что фактический липидный состав отклоняется от целевого соотношения (расхождение составило примерно 40%). Этосвидетельствует о том, что методhyFOPM может применяться для оценки качества при получении GUV.

Применение для исследования живых клеток

В дальнейшем метод hyFOPM был применендля исследования живых клеток: с его помощью отслеживалисьдинамические изменения содержания сфингомиелина и холестерина в двух клеточных моделях.

• Накопление сфингомиелина в клетках A549

Клетки аденокарциномы легкого человека (линия A549) обрабатывали противоопухолевым соединением — 2-гидроксиолеиновой кислотой (2-OHOA), которая, как ожидалось, должна была вызвать накоплениесфингомиелина. Были получены спектры в области «отпечатков пальцев» (1600–1400 см⁻¹) для 50 клеток; анализпоказал, чтоплощадьпикапри 1464 см⁻¹увеличиласьна 117% послеобработки, тогдакаквконтрольнойгруппезатотжепериодростсоставиллишь 23%. Впоследствиибылопроведеновизуализирующееисследование 3000 клеток с использованиемвсего четырех значений волнового числа (2852 см⁻¹длясуммарныхлипидов, 1540 см⁻¹дляамиднойполосы II белков, 1464 см⁻¹длясфингомиелинаи 1048 см⁻¹дляхолестерина). Результатыпоказали, чтоинтенсивностьсигналасфингомиелинапродолжала расти через 48 и 72 часа после обработки, в то время как сигнал холестерина не претерпел существенныхизменений.

• Насыщение клеток HEK холестерином

Клетки эмбриональной почки человека(HEK293) инкубировали совместно с комплексом метил-β-циклодекстрина и холестерина (MβCD-Chol) для повышения содержания холестерина в клеточной мембране. Анализ спектров в «дактилоскопической» области (fingerprint region) для 50 клетокпоказал, что после обработки площадь пика при 1048 см⁻¹увеличиласьна 161%, тогдакакинтенсивностьпикасфингомиелина (1464 см⁻¹) незначительноснизилась; этосогласуетсясизвестнымсвойствомциклодекстринаэкстрагироватьчастьмембранных липидов в процессе доставки холестерина.Многоволновое картирование 3000 клеток подтвердилоповышение сигнала холестерина, а также выявило незначительноеувеличение суммарного сигнала липидов при практически неизменном сигнале белков.

Значимость и перспективы

Данное исследование демонстрирует возможность различения липидныхмолекул со схожей химической структурой в живых клетках без использования меток. В отличие от традиционных методов, основанныхна флуоресцентном или изотопном мечении, метод hyFOPM позволяет избежать проблем, связанныхс эффективностью введения меток и вмешательством в клеточные функции; кроме того, его селективность можногибко адаптировать к спектральным характеристикам целевых липидов путем настройкиволновых чисел возбуждающего излучения.

Спектральная специфичность данной системы в области «отпечатков пальцев» (fingerprint region) превосходитпоказатели, достигаемые в области валентных колебаний связей C-H, что открывает возможности для различения большего числаподтипов липидов. В работе также отмечается, что использование передовых методов спектрального разделениясигналов, таких как алгоритмы глубокого обучения, должно способствовать дальнейшему повышению чувствительностии специфичности. Кроме того, фотоакустическаямикроскопия среднего инфракрасного диапазона позволяет получать изображения тканейна глубине более 150 мкм, что открываетперспективы применения метода для анализа толстых образцов или исследований *in vivo*. Технологическая оптимизация (например, использование методов разреженной спектральной выборки) и миниатюризация системы являются важными направлениями развитияданной технологии для ее внедрения в практику экспресс-диагностики (point-of-care) или рутинных лабораторных исследований.